为何有的卵囊中看不到细胞 BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG和RANKL的影响

　　[摘要]目的:研究BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG和RANKL的影响。方法:第5代人牙囊细胞免疫组化染色,检测人牙囊细胞中OPG和RANKL蛋白的表达;第5代人牙囊细胞与浓度为100 ng/ml的BMP-2共同孵育0h、1h、3h、6h、12h、18h,RT-PCR法检测OPG和RANKL基因表达的变化。结果:人牙囊细胞OPG、RANKL免疫组化染色阳性;100 ng/ml的BMP-2上调OPG蛋白的分泌,最佳效应时间为12～18h,下调RANKL基因的表达,最佳效应时间为6～12h。结论:人牙囊细胞存在OPG、RANKL蛋白的表达;100ng/ml的BMP-2可增强人牙囊细胞OPG蛋白分泌和基因表达,减弱RANKL基因的表达,降低RANKL/OPG的比值,抑制破骨细胞的形成。
　　[关键词]骨形成蛋白-2;人牙囊细胞;骨保护素;破骨细胞分化因子
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)09-1313-04
　　
　　Effects of BMP-2 on the expressions of OPG and RANK in the human dental follicle cells
　　SUN Hai-yan1,ZHANG Yong-kuan2,JIN Zuo-lin3,LIN Zhu3
　　(1.Department of Stomatology,the 307th Hospital of PLA,Beijing 100071,China; 2.Department of Stomatology,the 150th Hospital of PLA,Luoyang 471031,Henan,China; 3.Department of Orthodontics,the Fourth Millitary Medical University,Xi"an 710032,Shaanxi,China)
　　
　　Objective:To study the effects of BMP-2 on the expressions of OPG and RANKL in the human dental follicle cells.MethodsThe expressions of OPG and RANKL were examined in the 5th passage human dental follicle cells by immunohistochemical staining technique.The human dental follicle cells were co-cultured with 100 ng/ml BMP-2 for 0,1h,3h,6h,12h,18h,then the expressions of OPG and RANKL were assayed by Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). ResultsThe immunohistochemical staining of OPG and RANKL was positive. 100ng/ml BMP-2 up regulated the expression of OPG and the optimal time was 12h～18h,down regulated the expression of RANKL and the optimal time was 6h～12h.ConclusionsOPG and RANKL are expressed in human dental follicle cells. 100ng/ml BMP-2 up regulate the expression of OPG and down regulate the expression of RANKL.The decrease of RANKL/OPG inhibits osteoclastogenesis.
　　Key words: BMP-2;OPG;human dental follicle cells;RANKL
　　
　　牙囊组织起源于外胚间充质,是包绕成釉器周围的疏松结缔组织,在牙齿萌出和牙周组织形成中起重要作用,缺乏牙囊的牙齿不能萌出,而单核细胞在牙囊的聚集以及单核细胞分化成破骨细胞、进而吸收牙槽骨、形成牙齿萌出通道是牙齿萌出的关键。这个过程受许多细胞因子的调控,如集落刺激因子-1(CSF-1)、甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)、骨保护素(OPG)、破骨细胞分化因子(RANKL)等,这些因子直接或者间接诱导单核细胞进入牙囊。而牙齿萌出的过程伴随萌出牙齿冠方、根方牙槽骨的代谢,成骨与破骨在骨代谢中是密不可分的,骨形成蛋白-2(BMP-2)作为一种重要的成骨相关蛋白,在这个过程中又是如何发挥作用的呢?
　　本实验通过青少年第三磨牙牙囊细胞的培养,结合分子生物学技术,证明了人牙囊细胞中存在OPG和RANKL基因的表达;并分析BMP-2对人牙囊细胞中OPG和RANKL基因表达的影响;结果有助于阐明牙齿萌出的分子机制,也为临床阻生牙的正畸矫治以及牙胚的组织工程研究提供理论基础。
　　
　　1材料和方法
　　1.1 主要试剂和仪器:DMEM高糖培养基(Hyclone,USA);胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司);胰蛋白酶(GIBCO公司,进口分装);CO2细胞培养箱(Forma Scientific公司,USA);YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂);倒置显微镜及照像系统(Olympus,Japan);高速低温离心机(湖南湘雅仪器仪表总厂);BMP-2(Peprotech公司,USA);羊抗人OPG、RANKL抗体(Santa Cruz,USA);二抗试剂盒(北京中山生物技术公司);OPG ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司);TRIzol Reagent (Life Technologies, NY);RNA抽提试剂盒;逆转录试剂盒(Fermentas,USA);DNA marker(DGL-2000,北京天为时代);Taq DNA聚合酶、dNTPs、和引物 (上海生物工程公司);琼脂糖(Sigma,USA);PCR仪(MJ Research,USA);凝胶成像分析仪(Vitber tourmat公司,法国);核酸蛋白定量分析仪(Eppendorf公司,德国)
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 免疫组化法检测体外培养的人牙囊细胞OPG、RANKL蛋白的表达:取第5代人牙囊细胞进行细胞爬片,细胞长满至80%时,用40g/L多聚甲醛固定10min,爬片用PBS振洗5 min×3次后,3ml/L的Triton-X 100 滴在爬片上10min,增加细胞通透性;然后滴30ml/L的H2O2,37℃孵育10min,阻断内源性过氧化物酶;滴加羊血清在37℃条件下封闭15min;不洗,分别滴加羊抗人OPG、RANKL多克隆抗体后入湿盒4℃过夜,次日37℃复温1h,滴加二抗,37℃孵育15 min;滴加辣根过氧化物酶复合物,37℃孵育15min;以上每步之后用PBS振洗5min×3次,然后DAB显色,光镜控制。用PBS液替代一抗设立空白对照,其余步骤不变。经苏木精复染,逐级脱水透明后封片。
　　1.2.2RT-PCR法检测BMP-2对体外培养人牙囊细胞OPG、RANKL表达的影响
　　1.2.2.1 人牙囊细胞的处理:取第5代的人牙囊细胞,用2.5g/l的胰蛋白酶消化后,配成单细胞悬液,接种到直径为70mm的培养皿上,加含50ml/L FBS的高糖DMEM培养液5ml,次日去除未贴壁死细胞,当细胞汇合后,换含10ml/l FBS的DMEM培养3h后,加100ng/ml的BMP-2分别于0 h、1h、3h、6h、12 h、18h终止培养。
　　1.2.2.2 总RNA提取及检测:根据TRIzol Reagent产品说明提取总RNA,每个培养皿的细胞加1ml Trizol提取总RNA,室温作用5min后收集细胞样品,加入氯仿0.2ml充分混匀后室温作用2～3min,4℃下12 000r/min 离心15min,收集水相,加入0.5ml异丙醇混匀后室温作用10min。而后4℃下12 000r/min 离心10min,再用75%乙醇洗涤后,4℃下以7 500r/min离心5min,空气中自然干燥RNA后,用无RNA酶水溶解,取出少量稀释后用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。根据测定值调整RNA标本浓度为1μg/μl,-70℃保存备用。
　　1.2.3 cDNA第一链合成及扩增:根据Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 操作说明将5μg总RNA逆转录为cDNA,多聚酶链反应(PCR)条件为:94℃变性3min,94℃ 变性30s,58℃～59℃退火2s,4℃延伸30s,72℃延长5min,经过35个循环,
　　1.2.4 引物序列及参数:见表1。
　　1.2.5PCR产物分析:取PCR扩增产物10μl点样于10g/L琼脂糖凝胶, DL2000 Maker10μl作参照,80V电压下电泳,于紫外线箱中观察并照相记录。
　　1.2.6统计学分析:用Bandscan 5.0对结果进行灰度值分析。以样品的OPG或RANKL的灰度值与同一样品β-actin的灰度值之比作为评价OPG或RANKL表达量的指标,数据采用方差分析,应用SPSS11.0软件统计学分析。
　　
　　2结果
　　2.1 免疫组化法检测体外培养的人牙囊细胞OPG、RANKL蛋白的表达:人牙囊细胞胞浆中微弱表达OPG,空白组无表达,微弱表达RANKL,空白组无表达,如图1～5所示。
　　2.2BMP-2对体外培养人牙囊细胞OPG、RANKL表达的影响:如图5、表2所示BMP-2作用下HDFCs的OPG基因表达随时间逐渐增强,12h基因表达处于高峰(P 　　[4]Liu D,Yao S,Pan F,et al. Chronology and regulation of gene expression of RANKL in the rat dental follicle[J].Eur J Oral Sci,2005,113(5):404-409.
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　　[收稿日期]2010-06-05 [修回日期]2010-08-16
　　编辑/张惠娟